一、实验简介

抑郁症、阿尔兹海默症和帕金森氏病是三种常见的对脑功能产生重要影响的神经精神类疾病。目前研究此类疾病模型主要方法是建立相关的动物模型，并进行相关行为学的实验分析。

抑郁症是一种功能性神经障碍，以显著持久的心境低落为核心特征，伴随兴趣减退、体重变化、睡眠障碍、社交回避等，部分患者伴有焦虑或自杀倾向。

阿尔兹海默症（AD）是一种进行性神经退行性疾病，以认知功能障碍、记忆丧失、神经元死亡为主要特征，病理标志为β淀粉样蛋白（Aβ）沉积和Tau蛋白过度磷酸化。

帕金森氏病（PD）是一种运动障碍性疾病，主要症状包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓，核心病理为黑质多巴胺能神经元进行性丢失、α-突触核蛋白聚集形成路易小体。

二、实验流程

（一）抑郁症

1、动物造模

（1）糖皮质激素诱导抑郁：皮下注射外源性皮质酮，持续注射3周。

（2）慢性不可预知温和应激 (chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型：冷水浸泡、禁水禁食、气味刺激、光周期改变等应激方法，造模持续4周。

（3）慢性束缚应激（Chronic Restraint Stress，CRS）抑郁模型：控制实验动物在特制塑料管内数小时，限制全身活动自由并禁水禁食，造模持续4周。

2、抑郁行为学检测

（1）旷场实验：记录并分析实验动物在旷场中不同区域所待的时间及尿便次数、直立次数等行为。

（2）强迫游泳实验：记录并分析实验动物在局限环境（水中）挣扎行为和静止不动的情况。

（3）糖水偏好实验：记录并分析实验动物对蔗糖溶液（1%-2%)和普通水的饮用偏好情况。

（4）悬尾实验：记录并分析实验动物在悬挂状态下挣扎行为和肢体不动的情况。

（二）阿尔兹海默症

1、动物造模

Aβ注射模型：向海马区立体定位注射Aβ1-40，诱导急性神经元损伤。

（1）麻醉：SD或Wistar大鼠经腹腔注射 0.4% 戊巴比妥钠（0.2ml/10g）麻醉,继而固定于立体定向仪上。

（2）注射：按照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为零起点，前囟后3.5mm处为穿刺点，中线右侧旁开2 mm，而后牙科钻钻开颅骨，采用微量注射器自脑表面垂直进针3mm，(即AP=-3.5 mm, ML=2.0mm，DV=3.0mm)，双侧海马CA1区缓慢匀速注射Aβ1-40各10μg (1μl)，留针5 min后退针，骨蜡封闭颅骨孔后缝合切口。 （注意：注射时出血量较大的动物认定为失败，排除在实验之外。）

2、行为学检测

所有组别在给药一周后进行Morris水迷宫试验，试验分为定位航行实验和空间探索实验。

（1）定位航行实验：大鼠连续接受5天的训练，每天4次，每次时间间隔30min，记录下大鼠4个不同入水点和入水后找到平台所需要的时间，即逃避潜伏期。大鼠找到平台后或120s 内找不到平台（潜伏期记为 120s），则由实验者将其拿上平 台，在平台上休息15s再进行下一次试验。每天以小鼠4次训练 潜伏期的平均值作为小鼠当日的学习4次潜伏期的平均成绩作为当日的最终结果进入到最后统计。

（2）空间探索实验：实验的第6天，撤去平台，从距离平台的最远端入水后，记录下2mis内大鼠的游泳轨迹，并观察分析大鼠在目标象限的停留时间，以及它的穿越平台的次数。

3、检测指标

行为学结束后，摘取大鼠全脑，冰上剥去小脑，将剩余部分左右对切，一半放入4%多聚甲醛中固定，用于病理学检测。另一半取海马用于PCR和蛋白检测。

（1）组织病理学

①尼氏染色：海马组织固定后石蜡切片，进行尼氏染色，观察海马区神经细胞形态和数量。光学显微镜下，计数视野下每组大鼠同一部位的神经元数量，作统计分析。

②免疫荧光：免疫荧光染色，观察海马区Aβ1-40染色情况。荧光显微镜下，计数视野下每组大鼠同一部位的阳性斑块数量，作统计分析。

③TUNEL染色： 海马组织进行TUNEL染色，观察神经元凋亡情况。荧学显微镜下，计数视野下每组大鼠同一部位的阳性染色数量，作统计分析。

（2）标志因子水平：

①RT-qPCR检测：收集海马组织，提取RNA，反转录cDNA，PCR检测caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。

②Western-blot检测：收集海马组织蛋白，检测active-caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表达。

（三）帕金森氏病

1、动物造模

（1）6-羟多巴胺（6-OHDA）模型

6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）是多巴胺的羟基化衍生物，因其化学结构与DA类似，因此能够同DA竞争摄取位点，进而被摄入胞内。进入胞内后，6-OHDA能够被氧化分解，产生活性氧，通过MAO（单胺氧化酶）进一步产生氧自由基，或直接引起线粒体功能障碍，导致DA能神经元死亡。因其造成动物的生物化学和神经化学损伤类似于PD，故常被用于诱导动物PD模型。

①SD大鼠适应一周后，腹腔注射0.4%戊巴比妥钠（0.2ml/10g）麻醉，将麻醉后大鼠固定于脑立体定向仪上。剪开头皮后用棉签轻轻擦拭颅骨表面，暴露出前囟和后囟。

②调节立体定位仪，将前囟和后囟点的高度调节到一致。以前囟点为原点，找到注射位点所在的坐标。用颅骨钻沿注射坐标位点钻孔，以保证微量注射器进针时不碰到孔壁。使用微量注射器吸取6-OHDA（注意避光），缓慢插入注射位点，以0.5ul/min的速度将6-OHDA注射到目标脑区，注射剂量为4μl。

（2）MPTP模型

MPTP穿过血脑屏障，作用于神经胶质细胞，产生甲基苯基吡啶离子MPP+。MPP+抑制线粒体呼吸功能，产生氧自由基，从而损伤DA能神经元，造成细胞数量减少。灵长类动物对MPTP最敏感但受限制，大鼠和其他造模动物对此神经毒素具有较大的抵抗力，因此常用小鼠进行造模。

①快速模型：腹腔或皮下注射MPTP,试剂现配现用。快速模型可分为单次注射和多次注射。单次注射的剂为30mg/kg，该模型损伤轻，易恢复；多次注射的剂量为20mg/kg，每隔2h注射1次，共3-4次，该模型损伤快且严重，DA神经元的损伤到死亡可以在3d内完成。

②慢速模型：腹腔或皮下注射MPTP，试剂现配现用。慢速模型需多次注射，每天1次，单次注射的剂量为20mg/kg，连续注射5-7d。该模型的成活率较高，实验周期较长。

2、模型评价

帕金森动物模型会出现震颤麻痹、肌肉僵直等外在行为学上的症状，结合脑组织病理学指标。

（1）行为学实验：游泳试验，悬挂试验，爬杆实验。

（2）病理学指标：脑组织形态学（HE染色），纹状体及黑质内的神经元数量 。

（3）生化指标：纹状体内多巴胺定量检测，抗氧化酶活力检测。

三、注意事项

1、客户需要提供实验药物。

2、公司提供动物造模、基本实验步骤、图片及数据分析结果。

四、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。