一、实验简介

流式细胞术（Flow Cytometry，FC）是通过检测悬液中的单个细胞或其他生物粒子上所标记的荧光信号，来对单个细胞或生物粒子进行定量分析和分选的一种技术。经荧光标记的单细胞悬液在鞘液包裹下形成细流，使细胞排成单列依次通过激光检测区。仪器通过检测每个细胞的散射光信号（反映细胞大小、颗粒度等物理特征）和荧光信号（反映细胞表面或内部的分子表达），来精确识别不同特征的细胞亚群。

细胞周期检测最常用的DNA染料是碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）。PI能嵌入双链DNA的碱基对之间，在488nm激光激发下发出红色荧光（~617nm），其荧光强度与结合的DNA含量成正比。细胞核内DNA含量随周期进程发生周期性变化：G0/G1期，细胞处于静止或生长准备阶段，DNA含量为二倍体（2N），荧光强度最低；S期，细胞正在进行DNA复制，DNA含量从2N向4N递增，荧光强度介于G1和G2/M期之间，呈连续分布；G2/M期，DNA复制完成，准备进入或正处于分裂期，DNA含量为四倍体（4N），荧光强度最高。

细胞凋亡检测主要基于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞膜完整性丧失。经典方法是Annexin V与PI（碘化丙啶）的联合使用。在正常活细胞中，PS分布于细胞膜的内侧。凋亡早期，细胞膜不对称性丧失，PS会外翻至细胞膜外侧。Annexin V是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，能高亲和力地特异性结合外翻的PS。PI是一种核酸染料，不能透过完整细胞膜，因此正常活细胞和早期凋亡细胞不会被PI染色。只有当细胞膜完整性丧失（晚期凋亡或坏死）时，PI才能进入细胞核与DNA结合，发出红色荧光。因此，通过Annexin V和PI的不同组合可以区分细胞状态：Annexin V⁻/PI⁻，活细胞；Annexin V⁺/PI⁻，早期凋亡细胞（膜完整但PS外翻）；Annexin V⁺/PI⁺，晚期凋亡或坏死细胞（膜完整性已丧失）；Annexin V⁻/PI⁺：通常认为是坏死细胞或在制备过程中膜受损的细胞。

细胞增殖检测主要用于评估细胞的分裂能力和次数，常用BrdU/EdU掺入法和CFSE稀释法。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）或EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷）都是胸腺嘧啶的类似物。在细胞S期合成DNA时，它们会替代胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA链中。通过流式细胞术检测掺入的核苷类似物，即可识别出正处于S期的增殖细胞。而CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，进入细胞后与胞内蛋白共价结合，发出强烈绿色荧光。当细胞分裂时，CFSE荧光染料会平均分配到两个子代细胞中，因此子代细胞的荧光强度是亲代细胞的一半。随着分裂代数的增加，荧光强度逐级衰减。通过流式细胞仪追踪荧光强度的变化，可以推算出细胞分裂的次数和增殖情况。

二、实验流程

1、单细胞悬液制备。

2、细胞计数。

3、荧光抗体染色。

4、上机分析。

三、注意事项

1、客户提供新鲜组织或细胞或血液样本。新鲜组织离体后制成单细胞悬液，加入PBS/培养基内4℃运输；悬浮细胞直接收集于离心管中，常温或4℃运输；贴壁细胞建议胰酶消化后重悬离心后弃上清，将细胞沉淀置于冰上4℃运输；细胞样本也可置于培养瓶中常温运输；血液样本采集在EDTA/肝素钠的采血管内，按1：8（保护液：血液）的比例加入，混匀后4℃运输。

2、公司提供单细胞悬液制备、磁珠分选、流式分选、流式分析、细胞代养等服务。

四、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。