Western Blot（WB，蛋白质免疫印迹实验）是一种通过抗原-抗体特异性结合半定量检测样本中目标蛋白的技术。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，通过转膜将蛋白质转移到固相载体（PVDF或NC膜）上，然后用特异性抗体结合某特定抗原（目标蛋白），再与酶或荧光标记的第二抗体发生反应，经过底物显色以检测目标蛋白。现在Western Blot已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

 一、实验流程

1、样本制备：冰上使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞/组织提取蛋白质，通过BCA法或考马斯亮蓝法检测并调整样本浓度，样本中加入Loading Buffer煮沸。 

2、SDS-PAGE电泳：根据目标蛋白分子量选择分离胶浓度进行制胶，上样时在凝胶两侧孔中加Marker，其他样本上样量一致，恒压电泳。 

3、转膜：湿转法广泛用于各种分子量的蛋白质，更适合大分子蛋白，凝胶、膜和滤纸叠放制成“三明治”在转膜液中恒流转膜。半干转法适合小分子蛋白，预冷的转膜液浸泡“三明治”后转膜。 

4、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭1小时，避免非特异性结合。 

5、抗体孵育：一抗4℃过夜孵育。二抗室温避光孵育1小时。 

6、显影与分析：ECL试剂盒A/B液1:1混合孵育膜，化学发光成像仪捕获信号。

7、结果判读：通过ImageJ分析条带灰度值，目标蛋白灰度值/内参灰度值=相对表达量。

二、样本处理

1、组织样本：冰上采集新鲜组织，要求1cm³大小，注意去除非研究组织部分，并用预冷的生理盐水或1×PBS清洗干净，放入标记好的冻存管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存，干冰运输。

2、细胞样本： 

（1）贴壁细胞：至少提供1×10⁷个细胞。细胞弃去培养上清液，预冷PBS清洗1-2次，加少量预冷PBS用细胞刮刀刮取细胞，（或者细胞用胰酶消化后低速离心弃去上清液，PBS清洗1-2次）转入1.5ml离心管或冻存管中，低速离心（4℃ 1500rpm，5min）弃去上清，细胞沉淀用液氮速冻，转移至-80℃冰箱保存，干冰运输。

（2）悬浮细胞：至少提供1×10⁷个细胞。低速离心去除培养液，PBS清洗1-2次，转入 1.5ml 离心管中，低速离心（4℃ 1500rpm，5min）沉淀细胞，弃去PBS，细胞沉淀用液氮速冻，转移至-80℃冰箱保存，干冰运输。

3、全血样本：

（1）如果需要血细胞（淋巴细胞和单核细胞）：2-3ml新鲜血液使用抗凝管（EDTA 紫盖或肝素绿盖）收集，上下颠倒混合均匀，4℃保存，2h内使用细胞分离液（货号U22-420B）分离出淋巴细胞，-80℃冰箱保存，干冰运输。

（2）如果需要血清：2-3ml新鲜血液室温静置凝固10-20min，离心（2000-3000rpm，20min）收集上清，-80℃冰箱保存，干冰运输。

（3）如果需要血浆：2-3ml新鲜血液使用抗凝管（EDTA 紫盖或肝素绿盖）收集，上下颠倒混合均匀，4℃保存，离心（2000-3000rpm，20min）收集上清，-80℃冰箱保存，干冰运输。 (注意：避免将全血样本放入-20℃或者-80℃保存。)  

4、蛋白样本：提取好的蛋白样本加入loading buffer变性-80℃冰箱保存，干冰运输。。

5、其他样本：菌液、材料蛋白、外泌体、精液、卵母细胞等样本保证蛋白含量充足，干冰运输。

三、注意事项 

1、样本量充足：实验要求有足量且保证一定纯度的样本，一般要求10⁷个细胞或者1cm³大小的组织。

2、取材迅速：取动物组织时要在冰上快速取材，尽量清洗干净去除血液等污渍，避免影响实验结果。

3、无菌环境：将组织或细胞等样本迅速转移至无菌无酶的冻存管中。

4、标记清楚：取样前在冻存管上用防水记号笔做好标记，并记录清楚。

5、快速冻存：样本处理好后尽快转移至液氮或-80℃中速冻。

四：服务内容

我们拥有经验丰富的实验技术人员，配备先进的仪器设备，可根据您的实验需求和研究目标量身定制实验方案，为您提供从样本接收、实验操作到数据分析的全程一站式服务，严格的质量控制体系，确保实验数据的真实可靠，并提供详细的数据分析报告（包括完整的实验步骤和电子版扫膜结果等）。

五、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。