一、实验简介

克隆形成实验是测定细胞存活率和考察单个细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外连续6代以上，其后代所组成的细胞群体称为集落或克隆。每个克隆大小在0.3-1.0mm，含有50个以上的细胞，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，常用的手段有两个：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

平板克隆形成实验直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点是操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞; 缺点是细胞在贴壁前容易移动。

软琼脂克隆形成实验采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

克隆形成实验可以：

1）检测细胞经干预后的克隆形成能力来判断干预后是否影响细胞的增殖和存活能力；

2）验证肿瘤细胞对药物、放疗等在增殖能力方面的敏感性;

3）评价细胞在体内成瘤性：肿瘤细胞如果体外克隆形成能力越强，即表明体内成瘤性越强。

二、实验流程

（一）平板克隆形成实验

1、单细胞悬液制备：使用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，离心收集细胞沉淀，重悬并轻柔吹打成单个细胞，细胞悬浮于含有10%胎牛血清的培养基中；台盼蓝染色评估活细胞率（要求>90%），并通过细胞计数板调整浓度，可倍比稀释至1×103个/ml（通常贴壁细胞接种密度为100-1000个/孔）。

2、接种与给药：单细胞悬液以每孔50、100、200个细胞的梯度密度均匀接种至6孔板或培养皿；若需药物处理，在接种细胞24h-72h加入药物；

3、克隆培养：静置于37℃、5%CO₂培养箱中培养2-3周，每3天换液一次并观察克隆形成情况；当克隆直径达0.3-1.0mm（肉眼可见）时终止培养；

4、固定染色：PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30-60min；结晶紫或Giemsa染色10-30min，去除残留染液并干燥；

5、计数分析：显微镜下计数含50个以上细胞的克隆；使用ImageJ等软件进行图像分析，计算克隆形成率。克隆形成率公式：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

（二）软琼脂克隆形成实验

1、准备琼脂：制备1.2%和0.7%的琼脂，高压灭菌，在40℃恒温水浴锅中维持液态；

2、制备底层琼脂：将1.2%琼脂与2×完全培养基以1:1混合（不包含细胞）后铺于6孔板中，总体积1.5mL，37℃孵育30min使其凝固；

3、制备上层细胞悬液：按1:1的比例将0.7%的琼脂与2×完全培养基混匀（维持40-42℃，避免凝固），加入0.2mL的单细胞悬液，充分混匀，再加入6孔板中作为上层胶，每孔1.5mL，每孔500-5000个细胞。37℃孵育至凝固，在最上层加入1ml完全培养基，防止琼脂干燥；

4、细胞克隆培养：置于37℃、5% CO₂培养箱中培养1-3周，每3天换液一次，并观察细胞状态及克隆形成情况；当克隆直径达0.3-1.0mm（肉眼可见）时终止培养；

5、固定染色：PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30-60min；结晶紫或Giemsa染色10-30min，去除残留染液并干燥；

6、数据分析：显微镜下计数含50个以上细胞的克隆；使用ImageJ等软件进行图像分析，计算克隆形成率。克隆形成率公式：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% ，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

三、联系咨询

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