一、实验简介

细胞衰老（cellular senescence）是细胞在经历一定增殖周期或外界应激后，进入不可逆的生长停滞状态。衰老的一般特征是慢性DNA损伤应答（DDR）激活、细胞周期停滞、促炎因子和组织重塑因子的分泌增强、抗凋亡、代谢改变和内质网应激。衰老细胞往往表现出特征性的结构改变，包括细胞增大和扁平、溶酶体和线粒体堆积、细胞核变化以及质膜改变。

在细胞衰老过程中，SA-β-gal（Senescence-associated β-galactosidase，β-半乳糖苷酶）的活性在pH 6左右的酸性条件下显著增加，而在正常或癌变细胞中，这种活性要么不存在，要么非常低。这种活性的增加不是由于酶量的增加，而是与细胞衰老状态下细胞内环境的变化有关。该酶能水解X-gal，产生蓝色不溶性产物，在光学显微镜下可见。通过着色反应，观察细胞是否呈现蓝色，可以判断细胞是否处于衰老状态。正常增殖的细胞或早期癌细胞通常不表现出这种蓝色着色，而衰老细胞则会显示出明显的蓝色着色。

二、实验流程

（一）贴壁细胞

1、固定：在6孔板中培养的细胞上吸去培养液，PBS清洗，然后加入4%多聚甲醛室温固定15分钟。

2、染色：PBS清洗3次，每次3分钟，每孔加入SA-β-gal染色液1ml，37℃孵育过夜（可覆上保鲜膜防止干燥）。

3、观察：使用光学显微镜观察细胞并拍照记录。如果不能及时观察或计数，可以去除染色液，加入2ml PBS在4℃下可以保存数天；或者去除染色液，加上封片液封片，4℃可以保存更久。

（二）悬浮细胞

1、固定：离心收集细胞至1.5ml离心管内，PBS清洗一次，加1ml多聚甲醛室温固定15 min（固定时可在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结团）。

2、染色：离心吸弃上清，PBS清洗3次，每次3 min。每管加入0.5-1ml SA-β-gal染色液，37℃孵育过夜。

3、观察：取部分染色后的细胞，滴到载玻片上或孔板内，在光学显微镜下观察并拍照记录。如国不能及时观察计数，可以离心去除染色工作液，加入1ml PBS在4 ℃可以保存数天。如果离心，取细胞涂片，加上封片液封片，4℃可以保存更久。

（三）组织样本

1、固定：将组织制备成冰冻切片后，让切片复温。使用PBS清洗切片3次，每次持续5分钟。用免疫组化笔在组织周围画圈，然后加入足够覆盖组织的4%多聚甲醛固定30min。PBS清洗3次，每次8分钟。

2、染色：每片组织上加30μl的SA-β-gal染色液，确保切片完全浸没于染色液中，37℃孵育过夜（可覆上保鲜膜防止干燥）。

3、观察：去染色液，加封片液封片，在光学显微镜下观察并拍照记录。

三、联系咨询

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