一、实验简介

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，是生物体的重要生命特征。细胞增殖检测是评估正常细胞的健康状况、测定对毒性损伤的反应和抗肿瘤药效等最常见的方法。细胞增殖实验方法主要可分为三类：基于代谢活性的检测（如MTT/CCK8）、基于DNA合成的检测（如BrdU/EdU）和基于增殖标志物表达的检测（如Ki67）。

（一）基于代谢活性的检测：MTT和CCK8法通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖，特别适用于高通量药物筛选和毒性测试。

MTT法的原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。随后使用二甲基亚砜（DMSO）等有机溶剂溶解这些结晶，通过酶标仪在490nm波长附近测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

CCK8法是MTT的改进方法，其原理类似：CCK-8试剂中含有WST-8（一种水溶性四唑盐），在电子耦合试剂存在的情况下，能够被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物（Formazan）。产生的Formazan量与活细胞数量成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，即可间接反映活细胞数量。CCK8法避免了MTT法中的结晶溶解步骤，操作更为简便。

（二）基于DNA合成的检测：BrdU和EdU法通过标记新合成的DNA来直接反映细胞增殖情况，特别适用于细胞周期分析和精准的增殖检测。

BrdU法的原理：BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞DNA合成期（S期）能够代替胸腺嘧啶（T）掺入到新合成的DNA链中。随后通过特异性抗BrdU抗体与掺入的BrdU发生免疫反应，经显色或荧光检测即可识别正在进行DNA合成的增殖细胞。传统的BrdU检测需要进行DNA变性处理（如酸解、热解或酶解）使抗体能够接近BrdU抗原，这可能会损伤样品和影响细胞形态。

EdU法是BrdU的改进方法，其原理类似：EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA合成期（S期）代替胸腺嘧啶掺入新合成的DNA分子中。不同的是，EdU检测利用点击化学原理，EdU分子中的乙炔基能与荧光染料标记的叠氮化物发生高效特异性反应，形成稳定的三唑环，从而直接标记新合成的DNA。这种方法无需DNA变性和抗体识别，避免了样品损伤，操作更为简便快捷。

（三）基于增殖标志物表达的检测：Ki67免疫荧光检测是一种基于增殖相关核抗原表达的细胞增殖分析方法。Ki67蛋白是一种与细胞增殖相关的核抗原，在细胞周期的G1、S、G2和M期均有表达，而在静止期（G0期）几乎不表达，因而Ki67成为评估细胞增殖状态的理想标志物。

Ki67检测的原理：利用特异性抗Ki67抗体与细胞中表达的Ki67蛋白结合，再通过荧光标记的二抗进行检测和显色。Ki67阳性表明细胞处于活跃增殖状态，通过计算Ki67阳性细胞的比例（Ki67指数），可以评估细胞群体的增殖活性。Ki67指数越高，通常表示细胞增殖越活跃。

二、实验流程

（一）MTT/CCK8实验

1、取对数生长期的细胞，消化制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔通常接种100μl含适当数量细胞的培养基（贴壁细胞需预培养过夜使细胞贴壁，悬浮细胞则无需此步骤）。设置空白对照组、阴性对照组和实验组，每组设置3-6个复孔。

2、根据实验设计，向孔板中的细胞添加药物、基因干预等处理，继续培养24-72小时，具体取决于实验目的和细胞类型。

3、加入试剂并孵育：

（1）MTT法：每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），继续培养箱中孵育4小时。若药物可能与MTT反应，需先离心弃去培养液，用PBS轻轻清洗2-3次后，再加入含MTT的培养液。

（2）CCK8法：每孔直接加入10μl CCK-8溶液，培养箱中继续孵育0.5-4h（孵育时间需预先摸索）。

4、测定吸光度：

（1）MTT法：孵育后小心吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，轻微振荡使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光值。

（2）CCK8法：孵育后直接使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（无需更换培养基和添加溶解液）。

5、计算各组复孔的平均吸光度值，计算细胞存活率或抑制率。

（二）BrdU/EdU渗入实验

1、取对数生长期的细胞接种于培养板中，当细胞汇合度达60-90%时，在培养基中加入BrdU或EdU工作液。

BrdU法：通常使用10μM BrdU工作液，避光培养0.5-48h（根据实验目的调整）。

EdU法：通常使用50μM EdU工作液，避光培养6-7h。

2、弃去培养液，PBS清洗细胞2次。4%多聚甲醛室温固定15-30min。弃去固定液，PBS清洗后加入0.5% Triton X-100室温通透10-15min。

3、检测反应：

（1）BrdU法：DNA变性处理（如DNase I处理或酸变性）使双链DNA解链暴露BrdU抗原。然后加入抗BrdU一抗孵育，再加入荧光标记的二抗孵育。

（2）EdU法：无需DNA变性和抗体步骤，直接加入Click反应混合液（含荧光染料标记的叠氮化物）避光反应30min。

4、DNA复染与检测：使用DNA染料（如DAPI、PI或Hoechst）进行细胞核复染，用PBS清洗后，在荧光显微镜或流式细胞仪下观察和分析。BrdU/EdU阳性细胞显示特异性荧光信号，表明这些细胞处于活跃增殖状态。

（三）Ki67免疫荧光实验

1、样本制备与固定：

（1）细胞样品：对数生长期细胞用4%多聚甲醛固定15-30min，PBS清洗。

（2）组织样品：新鲜组织样本用4%多聚甲醛固定固定24-48h后进行石蜡包埋和切片，或进行冰冻切片。

2、通透与封闭：对于细胞样品，加入0.5% Triton X-100室温通透10-15min。对于组织切片，脱蜡和复水处理（石蜡切片）后加入封闭液室温封闭30-60min。

3、一抗孵育：加入稀释的抗Ki67一抗，4℃湿盒中过夜孵育或室温孵育2-4h。

4、二抗孵育：PBS清洗3次，每次5min，加入荧光标记（如FITC）的二抗，室温避光孵育1-2h。

5、DNA复染与封片：PBS清洗3次，每次5min，加入DNA染料（如DAPI）复染细胞核5-10min。PBS清洗后，用抗荧光淬灭封片剂封片。

6、在荧光显微镜下观察并拍照记录，观察Ki67阳性信号和DNA复染信号（蓝色）。随机选择多个视野，计数至少500个细胞中的Ki67阳性细胞数，计算Ki67指数（阳性百分比）。

三、注意事项

1、BrdU检测通常使用FITC标记的抗体，与GFP荧光蛋白一般不兼容，存在光谱重叠风险。

2、Ki67免疫荧光通常使用FITC或Cy3等荧光标记，与GFP/RFP等荧光蛋白一般不兼容，存在光谱重叠风险。

四、联系咨询

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