一、实验简介

稳转细胞系（稳定表达细胞株）构建指通过基因工程手段，将外源基因整合到宿主细胞基因组中，构建能够长期稳定表达特定基因或干扰特定基因表达的细胞株。稳转细胞株能弥补瞬时转染表达时间短的缺陷，广泛用于基因功能研究、药物筛选、重组蛋白和单克隆抗体生产等应用。

二、实验流程

1、构建重组表达质粒：将目的基因（需过表达或敲低的基因）插入慢病毒表达载体中，并确保慢病毒载体包含抗性标记和用于追踪的报告基因。

2、预实验：通过杀灭曲线实验确定确定用于筛选的抗生素对特定细胞系的最低完全致死浓度，通过梯度实验摸索确定最佳MOI（感染复数，即每个细胞感染的病毒颗粒数）。

3、病毒包装：将重组慢病毒质粒与包装质粒（如psPAX2）和包膜质粒（如pMD2.G）共转染到包装细胞（如293T)中。转染后48-72小时收集含有慢病毒颗粒的细胞上清液，必要时进行浓缩和滴度测定。

4、抗生素筛选：根据预实验确定的最佳MOI值，将慢病毒液加入到目标细胞中。

感染一定时间（通常是48-72小时）后，加入确定浓度的抗生素进行筛选。未成功整合病毒载体的细胞会全部死亡，而成功整合的细胞由于表达了抗性基因，能够存活并增殖。

5、多克隆稳转细胞株筛选和鉴定：存活下来的细胞群体是混合克隆，可初步用于实验，但其特性可能不均一。为获得性状均一、稳定的细胞株，常需进行单克隆筛选（有限稀释法或者流式细胞分选）。

6、验证与保种：在mRNA水平（如qRT-PCR）和蛋白水平（如Western Blot）检测目的基因的表达情况，根据实验目的进行相应的功能学实验，验证稳转细胞系是否达到预期效果。对验证合格的细胞株进行大量扩增并冻存保种。定期用抗生素维持压力，防止基因沉默或丢失。

三、结果交付

1、提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）。

2、稳转细胞株。

四、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。