一、实验简介

蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种基于抗体与抗原特异性结合原理，用于研究体内蛋白质间相互作用的经典方法，能够在接近天然的生理条件下捕获蛋白质复合物，真实反映细胞内核苷酸序列的相互作用关系。

当细胞在温和的非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被完整地保留下来。利用偶联在固相支持物（如琼脂糖珠或磁珠）上的特异性抗体，与细胞裂解液中共孵育，抗体便会特异性地捕获其靶蛋白（“诱饵蛋白”）。随后，与“诱饵蛋白”直接或间接结合的相互作用蛋白（“猎物蛋白”） 也会被一同沉淀下来。通过洗涤去除未结合的杂蛋白，最后洗脱并收集复合物，即可通过Western Blot（WB）对特定的“猎物蛋白”进行验证，或通过质谱（MS）分析来筛选未知的相互作用蛋白。

二、实验流程

1、样本准备与蛋白提取

细胞样本：收集细胞，用预冷PBS清洗。加入含蛋白酶抑制剂的非变性裂解缓冲液在冰上裂解30-60分钟。期间定期涡旋。4℃, 12,000-14,000 g离心15分钟，收集上清（即总蛋白）。

组织样本：液氮研磨组织，加入裂解液充分匀浆，冰上裂解后离心取上清。

取小部分上清作为Input（阳性对照），与上样缓冲液混合煮沸备用。

2、预清除：向总蛋白液中加入Protein A/G Beads，4℃旋转孵育1小时。离心去除Beads。此步骤可去除与Beads非特异性结合的蛋白，降低背景。

3、免疫沉淀：将总蛋白液分装至实验组和对照组，实验组加入靶蛋白的特异性抗体，阴性对照组加入同源物种的同型IgG或无关抗体。4℃旋转孵育过夜（或至少4小时），使抗体与靶蛋白充分结合。

4、Beads捕获与洗涤孵育液加入已用裂解液预洗过的Protein A/G Beads，4℃旋转孵育2-4小时，使抗体-Fc段与Beads结合。离心弃上清，用预冷的裂解液洗涤Beads沉淀物3-4次，彻底去除非特异性结合的杂蛋白。

5、洗脱与检测：向洗净的Beads中加入 1×SDS上样缓冲液，煮沸10分钟，使复合物从Beads上解离下来，离心取上清。通过SDS-PAGE分离样品，分别用靶蛋白和互作蛋白的抗体进行检测。若实验组能检测到互作蛋白，而对照组不能，则证明相互作用是特异的。

三、注意事项

1、客户需要提供新鲜组织（100mg以上）或细胞样本(10⁷个以上)，抗体及其相关信息。

2、我们提供原始图片、数据及实验报告。

四、联系咨询

攸碧艾欢迎您来电咨询实验服务，联系电话：400-681-8582。