一、实验简介

酪酰胺信号放大（Tyramide signal amplification，TSA）技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行高密度原位标记的酶学检测方法，荧光标记的酪胺分子在H2O2环境下被二抗标记的HRP催化激活，产生大量的酶促反应，使荧光素在抗原-抗体结合部位与组织周围的蛋白残基结合，形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。

TSA的详细原理是利用酪胺(Tyramide)的过氧化物酶反应（酪胺盐在HRP催化H₂O₂下形成共价键结合位点），产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。利用TSA技术做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后通过抗体洗脱液或者热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。后续可不必考虑上一轮实验中抗体的交叉干扰，即可直接使用不同或相同种属来源的抗体进行后续轮次的孵育，从而标记其它靶抗原。如此重复循环染色，等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果，实现同一个样品上的多重荧光染色。

二、实验流程

1、样本准备：

对于石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，蒸馏水洗5min。

对于冰冻切片：冰冻切片用4%多聚甲醛固定10-30min，PBS清洗5min，重复3次，滴加Triton-X 100通透20min，PBS清洗5min，重复3次。

对于细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本用4%多聚甲醛固定10-30min，PBS清洗5min，重复3次，滴加Triton-X100通透20min，PBS清洗5min，重复3次。

2、抗原修复：石蜡切片置于盛满抗原修复液的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min，或100℃水煮15min，或95℃水浴20min等热修复方法），中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤）。

3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、非特异性靶点封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加封闭液（如3%BSA）均匀覆盖组织，室温封闭30-60min。

5、孵育一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗，切片平放于避光湿盒内4℃孵育过夜或室温孵育1-2h（湿盒内加少量水防止蒸发），孵育结束将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

6、孵育二抗：切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS清洗3次。

7、TSA荧光标记：直接滴加50μl即用型TYR荧光染料，均匀覆盖组织室温孵育3-15min（最佳时间5-10min），PBS清洗三次（预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。

8、抗体洗脱（以下方法二选一，优先推荐使用抗体洗脱液进行洗脱）：

高温热修复法洗脱：组织切片置于抗原修复液中95℃水浴25-40min（根据不同抗体亲和力调整时间），注意避免干片。自然冷却后PBS清洗3次，每次5min。由于冰冻切片易脱片，本方法较适用于石蜡切片。

抗体洗脱液洗脱：滴加适量37℃预热的抗体洗脱液覆盖样本，37℃孵育5-20min。弃洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本，37℃孵育5-20min。弃洗脱液，PBS清洗3次，每次5min（本法更温和，石蜡切片、冰冻切片、细胞或骨组织等易脱落组织样品均可使用）。

9、重复3-8步骤（换用第二种TYR荧光染料），进行第二轮标记。

10、重复3-8步骤（换用第三种TYR荧光染料），进行第三轮标记。

11、重复3-8步骤（换用第四种TYR荧光染料），进行第四轮标记。

12、重复3-8步骤（换用第五种TYR荧光染料），进行第五轮标记。

13、重复3-7步骤（换用第六种TYR荧光染料），进行第六轮标记，最后一轮TSA染色后可以不进行抗体洗脱。

14、DAPI染色细胞核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染色液，室温避光孵育5-20min。

15、封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

16、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

三、联系咨询

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