一、实验简介

双荧光酶报告基因系统通常由萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase） 组成。萤火虫荧光素酶以荧光素（luciferin）为底物，在ATP和Mg²⁺存在的条件下催化其氧化，产生可检测的生物发光（黄绿色光，560nm）；而海肾荧光素酶则以腔肠素（coelenterazine）为底物，催化反应产生蓝光（480nm）。两种酶的底物和发光特性不同，检测互不干扰。

萤火虫荧光素酶作为主报告基因，其表达受待研究的调控序列（如启动子、miRNA靶序列）控制；海肾荧光素酶作为内参基因，由组成型启动子驱动，用于校正转染效率、细胞数量和细胞活性的变化。通过计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值来得到经过标准化的相对荧光素酶活性，使实验结果更准确准确。该系统被广泛应用于启动子活性分析、miRNA靶向互作验证、转录因子功能研究及信号通路调控等多个重要研究方向。

二、实验流程

1、验证miRNA同mRNA靶向互作：将待测mRNA的预测靶向序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA mimics。若萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

2、验证miRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA预测靶向序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。

3、启动子结构分析：将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体中替换启动子序列，检测其启动子活性。

4、验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。

以下为可供选择的载体：

1、pGL4.17[luc2/Neo]：信号通路报告载体，萤火虫Luc2（单报告基因）

2、pLuc2-hRluc(pGL4.10-hRluc) ：信号通路报告载体，萤火虫 Luc2+海肾hRluc（双报告基因）

3、pGL3-hRluc：双荧光素酶报告基因载体，萤火虫Luc2+海肾 hRluc（双报告基因）

4、pGL3-basic：荧光素酶报告基因载体，萤火虫luc+（单报告基因）

5、pmirGLO：pMir-Glo circRNA 3'UTR miRNA功能研究载体，荧光素酶报告系统质粒，萤火虫 luc2 + 海肾 hRluc-neo(双报告基因)

三、联系咨询

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