一、实验简介

CRISPR/Cas9是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA，gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination，HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

二、实验内容

1、CRISPR基因敲除：利用CRISPR/Cas9技术进行单基因或多基因敲除。其核心组成部分包括：

（1）单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）：负责识别靶基因DNA序列。

（2）具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白：负责切割DNA。

CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别靶基因DNA，并引导Cas9核酸内切酶对DNA进行剪切。基因组发生双链断裂后，细胞通过NHEJ机制进行修复，此过程通常会随机引入若干碱基的插入或缺失。若插入或缺失的碱基数非3的倍数，就会导致阅读框移位，从而造成基因功能失活，实现基因敲除。

图1  CRISPR / Cas9 KO原理

2、CRISPR过表达：利用CRISPR/Cas9进行单基因过表达。

通过修饰CRISPR/Cas9系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。

CRISPR-SAM系统由三部分组成：

（1）失去核酸酶活性的dCas9 (deactivated Cas9) -VP64融合蛋白。

（2）含2个MS2 RNA adapter的sgRNA。

（3）MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。

CRISPR-SAM系统中的MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator（协同激活调节器），这也就是CRISPR-SAM的命名由来。CRISPR-SAM借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等（均为转录激活因子）拉拢到目的基因启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而增强基因的转录表达。

三、联系咨询

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