RRBS甲基化测序
Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点，与基因表达、表型性状息息相关。RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。利用RRBS可以实现多个样本的比对基因组分析。
技术优势：
1. 直接针对酶切富集启动子区域以及CpG岛区域进行甲基化研究。
2. DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率，有效增加了测序深度。
3. 可以与单细胞测序技术结合，进行细胞细胞RRBS测序。
技术线路：
样本准备：
（1）样品总量：≥ 3 μg DNA（常规样本），≥ 5 μg DNA（FFPE或降解DNA样本）；
（2）样品纯度：OD260/280 = 1.8-2.0；
（3）样品完整性：DNA无明显降解与蛋白污染，需提供凝胶电泳检测胶图。
数据分析：
应用案例：
研究背景：
1.DNA甲基化发育和疾病中起着重要的作用。脊椎动物的DNA甲基化主要位点是在CpG二核苷酸的胞嘧啶背景下，此类型大约占人类细胞和小鼠细胞的总甲基化含量四分之三。尽管我们对CpG甲基化的基因组分布、个体间的稳定性、功能作用有深入的研究，但是对CPA，CPT和CPC（非CpG岛）二核苷酸的DNA甲基化方面知之甚少。
2.利用RRBS测序，我们对人类多功能细胞和分化细胞的非CpG甲基化与76个基因组库的DNA甲基化图谱进行深入分析，确认了非CpG甲基化主要存在多能干细胞类型，与DNMT3表达水平存在很强的相关性，并且可能与CpG甲基化存在空间上的相关性。通过大规模代表性样本的研究，有助于我们进一步了解人类细胞中的胞嘧啶甲基化模式。
研究方法：
1. 提取20种人类胚胎干细胞株、12种人类诱导多功能干细胞、10种不同人类体细胞DNA。
2. RRBS测序检测非甲基化。
3. 生物信息学分析。
分析结果：
1. 人类不同细胞类型的CpG甲基化和分布情况。在40-260bp区域内，检测到3.4million CpG 二核苷酸和11.5million非CpG二核苷酸，与之前公布的hESC（human embryonic stem cells）株H1的WGBS数据库比较，两者重叠的CpG甲基化区域占很大部分，且非CpG甲基化程度都比较低。
2. 敲除DNMT3A基因，导致人类胚胎干细胞全面减少非CpG甲基化水平,而且CpA甲基化动态水平变化与DNMT3基因表达水平密切相关，降低CpA甲基化程度，同时会伴随着DNMT3A和DNMT3B基因表达水平下降。
