lncRNA测序
长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是指长度在200~100000 nt之间不具有蛋白编码功能的RNA分子。 它们存在带polyA尾和不带polyA尾两种形式,具有跨物种的低保守性,组织特异性表达和丰度低等特点。lncRNA的种类远远超过编码RNA,保守估计哺乳动物基因组序列中4%~9%的序列产生lncRNA转录本,而相应的蛋白编码RNA的比例仅是1%~5%。目前研究提示lncRNA的功能机制主要包括参与转录调控、转录后调控、蛋白质运输和mRNA降解。lncRNA已经成为非编码RNA研究领域的一个热点,借助高通量测序,研究人员能够快速获得与疾病或者特定生物学过程相关的lncRNA并进行深入研究。
技术优势:
(1)信息完善:去rRNA的建库方法,使得一个文库可以同时进行lncRNA和mRNA的分析,节省了实验成本;
(2)准确度高:链特异性建库方法,使得反义lncRNA的鉴定更加准确;
(3)前瞻性好:能发现大量未知的lncRNA信息,适合各类物种的研究;
(4)完整性:获取完整的lncRNA转录信息。
技术线路:
样本准备:
(1)样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。
(2)样品量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供2 μg以上的总RNA。
(3)样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~阿2.2之间,浓度≥ 500 ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。
(4)样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。
(5)样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。
数据分析:
应用案例:
本研究对人类结肠癌组织和正常黏膜组织进行RNA测序,两种样本分别得到52M和59M reads。通过比较发现,人类结直肠癌组织中的MYC基因上游515 kb处特异性地转录生成一种长链非编码RNA—CCAT1-L。功能研究表明,抑制CCAT1-L 会降低MYC基因表达;过表达CCAT1-L,会增强MYC基因表达,并促进肿瘤发生。进一步研究发现,编码这种lncRNA的基因座定位在一个超级增强子中,该lncRNA—CCAT1-L通过调节CTCF与染色质的结合来促进MYC基因增强子与启动子远程染色质环的形成。以上研究结果表明,lncRNA在肿瘤形成的过程中充当了一种重要的调控因子。
研究方法:
1) RNA-seq发现结肠癌组织lncRNA—CCAT1-L;
2) 用northern blot和qRT-PCR在其它病人的结肠癌组织进行验证;
3) ASO knockdown 和过表达研究CCAT1-L功能;
4) ChIP研究CCAT1-L调控染色质成环机制。
结果分析:
1. 结直肠癌组织中的MYC基因上游515 kb位点特异性地生成的lncRNA—CCAT1-L。
2. 编码CCAT1-L的基因座定位在一个超级增强子中。